Этап № 5

В ходе выполнения проекта по Соглашению о предоставлении субсидии от 27.06.2014 г. № 14.604.21.0061 с Минобрнауки России в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы» на заключительном этапе № 5 в период с 01.07.2016 г. по 31.12.2016 г. выполнялись следующие работы:

1. Выбор состава композиционного препарата, содержащего конъюгаты или конструкции алендроновой кислоты с ФНО-альфа и ИФН-гамма, отличающегося наибольшей противоопухолевой и антирезорбтивной активностью. Проверка соответствия разработанных технологических решений требованиям ТЗ.
2. Проведение дополнительных физико-химических и биологических исследований для уточнения оптимального состава композиционного препарата.
3. Разработка заключительного отчета о ПНИ.
4. Проведение дополнительных исследований по уточнению метода получения композиционного препарата.
5. Разработка Инструкции по изготовлению и контролю композиционного препарата, содержащего конъюгаты или конструкции алендроновой кислоты с ФНО-альфа и ИФН-гамма.
6. Разработка проекта ТЗ для проведения последующих НИОКР.

При этом были получены следующие результаты:

1. Обоснован выбор состава композиционного препарата, представляющего собой лиофильно высушенную композицию, содержащую в качестве активного начала смесь конъюгатов ФНО-альфа с алендроновой кислотой и ИФН-гамма с алендроновой кислотой в молярном соотношении 1:1 в количестве 0,5 мг белка на дозу, в качестве вспомогательных веществ: Д-маннит – 50 мг, поливинилпирролидон – 25 мг на дозу. Подтверждено соответствие разработанных технологических решений требованиям ТЗ.
2. Получены экспериментальные образцы композиционного препарата, содержащего конъюгаты ФНО-альфа и ИФН-гамма с алендроновой кислотой, с разными соотношениями компонентов (5:1, 100:1, 1:10 и 1:100). Показано, что все композиции отличались высокой чистотой и специфической активностью, белковые компоненты композиций сохраняли способность к образованию димеров и тримеров.
3. На экспериментальной модели костных метастазов меланомы B16-F10 проведено исследование противоопухолевой и антирезорбтивной активности композиций конъюгатов ФНО-альфа и ИФН-гамма с алендроновой кислотой с разными соотношениями компонентов. Подтверждено, что наиболее выраженной противоопухолевой активностью в отношении опухолевых метастазов костей и нормализующим воздействием на костную ткань отличалась композиция конъюгатов ФНО-альфа и ИФН-гамма с алендроновой кислотой в соотношении 1:1.
4. Показано, что ФНО-альфа и ИФН-гамма, конъюгированные с алендроновой кислотой, в составе композиции (1:1) сохраняли способность к ди- и тримеризации. Методами спектрометрического анализа показано, что конъюгирование ФНО-альфа и ИФН-гамма с алендроновой кислотой не приводило к заметным изменениям вторичной структуры белков.
5. Установлено, что ФНО-альфа и ИФН-гамма, конъюгированные с алендроновой кислотой, после введения в составе композиции (1:1) быстро элиминируются из русла крови и в высоких концентрациях накапливаются в ткани экспериментальных костных метастазов, индуцированных введением клеток лейкоза L1210/1.
6. Проведены дополнительные исследования по уточнению временных параметров процесса получения композиционного препарата, наработаны две серии конъюгатов ФНО-альфа и ИФН-гамма с алендроновой кислотой и композиций на их основе с соотношением 1:1. Показано, что выбранные технологические параметры процесса конъюгирования и получения композиционных препаратов позволяют получать препараты высокой чистоты и гомогенности, со стабильными биологическими свойствами, что, в свою очередь, указывает на воспроизводимость технологического процесса.
7. На основании данных, полученных при отработке метода и результатов дополнительных исследований, разработана Инструкция по изготовлению и контролю композиционного препарата, содержащего конъюгаты алендроновой кислоты с ФНО-альфа и ИФН-гамма.
8. Разработан Проект ТЗ для проведения прикладной НИОКР по разработке технологии получения и проведению доклинических исследований лекарственного средства для лечения костных метастазов на основе композиции конъюгатов рекомбинантных ФНО-альфа и ИФН-гамма человека с бифосфонатом алендроновой кислотой.

Задачи, поставленные на заключительном пятом этапе проекта, выполнены полностью. Полученные результаты соответствуют требованиям к выполняемому проекту.

Комиссия Минобрнауки России признала обязательства по Соглашению на отчетном этапе исполненными надлежащим образом.

Этап № 4

В ходе выполнения проекта по Соглашению о предоставлении субсидии от 27.06.2014 г. № 14.604.21.0061 с Минобрнауки России в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы» на этапе № 4 в период с 01.01.2016 г. по 30.06.2016 г. выполнялись следующие работы:

1. Получение экспериментальных образцов композиций, содержащих конъюгаты или конструкции алендроновой кислоты с ФНО-альфа и ИФН-гамма.
2. Исследование противоопухолевой и антирезорбтивной активности конъюгатов алендроновой кислоты с ФНО-альфа или ИФН-гамма, и их композиций на экспериментальной модели костных метастазов.
3. Исследование противоопухолевой и антирезорбтивной активности конструкций, содержащих алендроновую кислоту, ФНО-альфа или ИФН-гамма, и их композиций на экспериментальной модели костных метастазов.
4. Выбор на основании экспериментальных данных эффективного средства доставки ФНО-альфа и ИФН-гамма в область костных метастазов.
5. Разработка промежуточного отчета о ПНИ.
6. Проведение патентных исследований по ГОСТ Р 15011-96.
7. Оформление заявки на патент.

При этом были получены следующие результаты:

1. Наработаны экспериментальные образцы конъюгатов рекомбинантного ФНО-альфа человека и алендроновой кислоты в количестве 43,5 мг и конъюгатов рекомбинантного ИФН-гамма человека и алендроновой кислоты в количестве 19,2 мг. Установлено, что препараты отличаются высокой степенью чистоты (>95%) и высоким уровнем специфической активности (8,9×107-1,46×108 МЕ/мг для конъюгата ФНО-альфа и 1,1-2,2×107 МЕ/мг-для конъюгата ИФН-гамма).
2. Наработаны экспериментальные образцы конструкций, содержащих ФНО-альфа и алендроновую кислоту, в количестве 9,75 мг и конструкций, содержащих ИФН-гамма и алендроновую кислоту, в количестве 5,48 мг. Показано, что препараты отличаются высокой степенью чистоты (>95%) и высоким уровнем специфической активности (5,2×106 МЕ/мг для конструкции с ФНО-альфа и 2,8×106 МЕ/мг-для конструкции с ИФН-гамма).
3. Получены и охарактеризованы образцы композиционных препаратов конъюгатов ФНО-альфа или ИФН-гамма с алендроновой кислотой с молярным соотношением компонентов 1:1 и 10:1 общим количеством 18 мг (по белку), а также композиции конструкций, содержащих ФНО-альфа или ИФН-гамма и алендроновую кислоту, с соотношением компонентов 1:1 и 9:1 в количестве 5,08 мг. Получены данные, подтверждающие сохранность в композиционных препаратах активности белков-цитокинов.
4. В культуре клеток меланомы B16-F10 установлено, что как ФНО-альфа, так и ИФН-гамма обладают умеренно выраженной противоопухолевой активностью. Продемонстрирован синергидный эффект препаратов при сочетанном применении. Показано, что конъюгирование ФНО-альфа с алендроновой кислотой не приводило к снижению либо усилению цитотоксической активности ФНО-альфа in vitro. Молекулярная конструкция, содержащая ФНО-альфа, алендроновую кислоту и дсРНК, обладала более выраженными цитотоксическими свойствами в отношении клеток меланомы B16-F10, по сравнению с ФНО-альфа.
5. На экспериментальной модели костных метастазов меланомы B16-F10, индуцированных внутрисердечным введением мышам клеток опухоли, установлено, что конъюгаты и конструкции, содержащие ФНО-альфа и ИФН-гамма, обладают противоопухолевой и антирезорбтивной активностью. Наиболее выраженный и стабильный эффект был зарегистрирован после введения композиции, содержащей конъюгаты ФНО-альфа и ИФН-гамма в соотношении 1:1. На основании полученных данных обоснован выбор средства адресной доставки белков к костным метастазам.
6. Проведены патентные исследования по ГОСТ Р 15011-96. Оформлена и направлена в патентное ведомство РФ заявка на изобретение «Способ получения противоопухолевого средства против метастазов костей в виде конъюгата белка-цитокина и аминобифосфоната». Заявка № 2016124110 от 17.06.2016 г.

Задачи, поставленные на четвертом этапе проекта, выполнены полностью. Полученные результаты соответствуют требованиям к выполняемому проекту.

Комиссия Минобрнауки России признала обязательства по Соглашению на отчетном этапе исполненными надлежащим образом.

Этап № 3

В ходе выполнения проекта по Соглашению о предоставлении субсидии от 27.06.2014 г. № 14.604.21.0061 с Минобрнауки России в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы» на этапе № 3 в период с 01.07.2015 г. по 31.12.2015 г. выполнялись следующие работы:

1. Разработка методов получения конструкций, содержащих алендроновую кислоту, ФНО-альфа или ИФН-гамма.
2. Получение экспериментальных образцов конструкций, содержащих алендроновую кислоту, ФНО-альфа или ИФН-гамма.
3. Проведение физико-химических исследований конструкций, содержащих алендроновую кислоту, ФНО-альфа или ИФН-гамма, и компонентов в их составе.
4. Исследование накопления конструкций, содержащих алендроновую кислоту, ФНО-альфа или ИФН-гамма, в костной ткани.
5. Исследование накопления конструкций, содержащих алендроновую кислоту, ФНО-альфа или ИФН-гамма, в опухолевой ткани.
6. Проведение патентных исследований по ГОСТ Р 15011-96.
7. Оформление заявки на патент.

При этом были получены следующие результаты:

1. Отработаны условия получения конструкции, содержащей в центральной части двуспиральную РНК из дрожжей Saccharomyces cerevisiae, покрытую оболочкой из конъюгата полисахарида декстрана с ФНО-альфа (или ИФН-гамма), алендроновой кислотой и спермидином, удерживаемых в результате электростатического взаимодействия. Оформлены Методики получения конструкций, содержащих алендроновую кислоту, ФНО-альфа или ИФН-гамма.
2. Разработан метод получения конструкций, представляющих собой микрокапсулы на основе поливинилпирролидона, содержащие в центральной части ФНО-альфа (или ИФН-гамма), в составе полимерной оболочки-конъюгат ФНО-альфа (или ИФН-гамма) с алендроновой кислотой.
3. Апробированы методы получения конструкций, содержащих ФНО-альфа и алендроновую кислоту, удерживаемых в составе частицы в результате электростатических взаимодействий с белком протамином. Показано, что в условиях, близких к физиологическим, ФНО-альфа и протамин за счет взаимодействия заряженных групп на поверхности белков в прочном комплексе не удерживаются.
4. Апробированы методы получения конструкций, представляющих собой карбонатные наночастицы, содержащие ФНО-альфа и алендроновую кислоту, покрытые оболочкой из поли-L-лизина, удерживаемого за счет ионного взаимодействия. Показано, что сорбция алендроновой кислоты на поверхности положительно заряженных частиц не приводила к значимому повышению сродства частиц к гидроксилапатиту.
5. Наработаны и охарактеризованы экспериментальные образцы конструкций на основе дсРНК и конъюгатов декстрана с ФНО-альфа, алендроновой кислотой и спермидином или декстрана с ИФН-гамма, алендроновой кислотой и спермидином в количестве 7,5 мг и 6 мг, соответственно.
6. Установлено, что основным компонентом препарата молекулярной конструкции, содержащей конъюгат ФНО-альфа и алендроновой кислоты с декстраном, являются округлые наночастицы размером 25-45 нм, несущие отрицательный заряд. Конъюгирование ФНО-альфа не приводило к серьезным нарушениям структурных и конформационных свойств белка, о чем свидетельствует сохранение его способности к связыванию со специфическими антителами, цитолитической активности и протеолитической устойчивости.
7. Основным компонентом препарата молекулярной конструкции, содержащей конъюгат ИФН-гамма и алендроновой кислоты с декстраном, являются отрицательно заряженные наночастицы округлой формы размером 10-20 и 20-55 нм. Конъюгирование ИФН-гамма с декстраном и алендроновой кислотой не вызывало нарушений структурно-конформационных свойств белка, о чем свидетельствует сохранение его специфической противовирусной активности и устойчивости к протеолизу, хотя наблюдалось снижение способности белка к связыванию со специфическими антителами, обусловленное, скорее всего, экранирующим действием молекулы-спейсера.
8. Наработаны и охарактеризованы экспериментальные образцы конструкций в виде полимерных микрокапсул, содержащих ФНО-альфа и конъюгат ФНО-альфа с алендроновой кислотой, в количестве 2,2 мг, а также микрокапсул, содержащих ИФН-гамма и конъюгат ИФН-гамма с алендроновой кислотой, в количестве 1,25 мг.
9. Установлено наличие в препарате ФНО-альфа, инкапсулированного в микрокапсулы с алендроновой кислотой, отрицательно заряженных частиц размером 10-35 нм. Показано, что ФНО-альфа в составе частиц имеет молекулярную массу, соответствующую массе нативного белка, отличается сниженной способностью к связыванию со специфическими антителами при сохранении высокого уровня цитолитической активности. Процесс инкапсулирования не приводил к изменению протеолитической устойчивости ФНО-альфа.
10. Установлено, что конструкции, содержащие ИФН-гамма и алендроновую кислоту, представляют собой наночастицы округлой формы размером от 15 до 30 нм, однородные по структуре, имеющие неровную поверхность и несущие отрицательный заряд. Белок в составе микрокапсул утрачивал способность к связыванию со специфическими антителами, но сохранял высокий уровень противовирусной активности. Процесс инкапсулирования приводил к повышению протеолитической устойчивости ИФН-гамма.
11. На модели костной ткани in vitro показано, что все разработанные конструкции, содержащие ФНО-альфа, ИФН-гамма и алендроновую кислоту, обладают высоким сродством к гидроксилапатиту, аналогу минерального матрикса костной ткани.
12. На модели костных метастазов, индуцированных введением мышам клеток лимфоцитарного лейкоза L1210/1, установлено, что конструкции, содержащие ФНО-альфа и алендроновую кислоту в составе конъюгата с декстраном, отличались более высокой способностью к накоплению в опухолевой ткани метастазов, по сравнению с исходным белком.
13. Показано, что ИФН-гамма в составе конструкции с алендроновой кислотой и декстраном, более быстро исчезал из русла крови по сравнению с исходным белком и отличался высокой способностью к накоплению в опухолевой ткани. Существенных отличий в уровне накопления ИФН-гамма в составе конструкции от свободного белка не обнаружено, что может быть связано с различиями в динамике их накопления.

Полученные данные свидетельствуют о том, что введение ФНО-альфа или ИФН-гамма в структуру конструкций в сочетании с алендроновой кислотой не приводит к существенным нарушениям структуры и физико-химических свойств белков, потере их биологической активности. Исключением является снижение способности к связыванию со специфическими антителами, обусловленное, скорее всего, экранированием белка молекулами спейсера или полимерной оболочки. Продемонстрирована повышенная способность ФНО-альфа и ИФН-гамма в составе конструкций к связыванию с гидроксилапатитом-аналогом минерального матрикса костной ткани, конструкций, содержащих ФНО-альфа - к повышенному накоплению в ткани экспериментальных опухолевых метастазов.

Задачи, поставленные на третьем этапе проекта, выполнены полностью.

Полученные результаты соответствуют требованиям к выполняемому проекту.

Этап № 2

В ходе выполнения проекта по Соглашению о предоставлении субсидии от 27.06.2014 г. № 14.604.21.0061 с Минобрнауки России в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы» на этапе № 2 в период с 01.01.2015 г. по 30.06.2015 г. выполнялись следующие работы:

1. Разработка методов синтеза конъюгатов алендроновой кислоты с ФНО-альфа или ИФН-гамма.
2. Получение экспериментальных образцов конъюгатов алендроновой кислоты с ФНО-альфа или ИФН-гамма.
3. Проведение физико-химических исследований конъюгатов алендроновой кислоты с ФНО-альфа или ИФН-гамма и их компонентов в составе конъюгатов.
4. Разработка промежуточного отчета о ПНИ.
5. Исследование накопления конъюгатов алендроновой кислоты с ФНО-альфа или ИФН-гамма в костной ткани.
6. Исследование накопления конъюгатов алендроновой кислоты с ФНО-альфа или ИФН-гамма в опухолевой ткани.

При этом были получены следующие результаты:

1. Апробированы три вида методов конъюгирования фактора некроза опухоли альфа с алендроновой кислотой с использованием (1-этил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимида (EDC) и двух типов бифункциональных сшивающих агентов: сульфосукцинмидил-4-[N-малеимидометил]-циклогексан-1-карбоксилата (Sulfo-SCMM) и глутарового альдегида, отработаны условия проведения реакций конъюгирования.
2. Апробированы два вида методов конъюгирования аналога интерферона гамма Дельтаферона с алендроновой кислотой с использованием Sulfo-SCMM и глутарового альдегида, отработаны условия проведения реакций конъюгирования.
3. Установлено, что выбранные условия синтеза на нерастворимом носителе позволяют получать конъюгаты ФНО-альфа и ИФН-гамма с заданной стехиометрией, близкой к 1:1, и исключают образование межмолекулярных сшивок белка.
4. Наработаны и охарактеризованы экспериментальные образцы конъюгатов ФНО-альфа и АЛН и ИФН-гамма с АЛН. Все образцы отличались высокой (более 95%) чистотой и гомогенностью.
5. Проведены физико-химические исследования конъюгатов ФНО-альфа с АЛН. Подтверждено соответствие молекулярной массы ФНО-альфа в составе конъюгатов молекулярной массе исходного белка, способность ФНО-альфа к образованию тримеров в физиологических условиях и связыванию со специфическими антителами. Анализ специфической активности конъюгатов ФНО-альфа с алендроновой кислотой подтвердил сохранность цитотоксических свойств ФНО-альфа в составе конъюгатов всех трех типов.
6. Проведены физико-химические исследования конъюгатов ИФН-гамма с АЛН. Показано, что молекулярная масса ИФН-гамма в составе конъюгатов соответствовала молекулярной массе исходного белка. Подтверждена способность ИФН-гамма в составе конъюгатов к связыванию со специфическими антителами и высокий уровень их специфической противовирусной активности.
7. На модели костной ткани in vitro показано, что конъюгаты ФНО-альфа и ИФН-гамма с алендроновой кислотой обладают высоким сродством к гидроксиапатиту, аналогу матрикса костной ткани.
8. На модели костных метастазов, индуцированных введением мышам клеток лимфоцитарного лейкоза L1210/1, установлено, что конъюгаты ФНО-альфа или ИФН-гамма с алендроновой кислотой более интенсивно накапливались в клетках метастатического узла по сравнению с исходными белками.

Полученные данные свидетельствуют о том, что введение в структуру ФНО-альфа или ИФН-гамма остатка алендроновой кислоты не приводит к нарушению конформационных свойств белков и потере биологической активности. Продемонстрирована повышенная способность ФНО-альфа и ИФН-гамма в составе конъюгатов к накоплению в костной ткани и экспериментальных костных метастазах мышей.

Задачи, поставленные на втором этапе проекта, выполнены полностью. Полученные результаты соответствуют требованиям к выполняемому проекту.

Комиссия Минобрнауки России признала обязательства по Соглашению на отчетном этапе исполненными надлежащим образом.

Этап № 1

В ходе выполнения проекта по Соглашению о предоставлении субсидии от 27.06.2014 г. № 14.604.21.0061 с Минобрнауки России в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы» на этапе № 1 в период с 27.06.2014 г. по 31.12.2014 г. выполнялись следующие работы:

1. Аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы по проблеме разработки лекарственных препаратов на основе бифосфонатов и биологически активных веществ пептидной природы для лечения костных патологий, статей в ведущих зарубежных и российских научных журналах, монографий и патентов – не менее 50 научно-информационных источников за период 2008-2014 гг.
2. Обоснование выбора направления исследований.
3. Разработка Программы экспериментальных исследований.
4. Выбор и обоснование экспериментальной модели костных метастазов, методов оценки эффективности противоопухолевого и антирезорбтивного действия конъюгатов или конструкций алендроновой кислоты с ФНО-альфа и ИФН-гамма.
5. Получение рекомбинантных ФНО-альфа и ИФН-гамма человека, компонентов конъюгатов и конструкций, охарактеризованных по специфической активности и физико-химическим показателям в соответствии с проектами ФСП.
6. Проведение патентных исследований по ГОСТ 15.011-96.
7. Наработка биомассы штаммов-продуцентов ФНО-альфа и ИФН-гамма человека.

При этом были получены следующие результаты:

1. Проведен поиск и анализ современной научно-технической, нормативной, методической литературы по проблеме, оформлен аналитический обзор «Разработка лекарственных препаратов на основе бифосфонатов и биологически активных веществ пептидной природы для лечения костных патологий, в том числе, костных метастазов опухолей» (на 45 стр., 91 источник, из них – 71 источник за 2008-2014 гг.). Выполнены патентные исследования в соответствии с ГОСТ 15.011-96, оформлен отчет. Подготовлена и опубликована статья: Даниленко Е.Д., Белкина А.О. Использование бисфосфонатов в качестве средства доставки лекарственных препаратов. Биофарм. ж. 2014. Т.6, № 6. С.44–53.
2. Обоснованы выбор направления исследований, включая обоснование выбора методов получения конъюгатов и конструкций, содержащих алендроновую кислоту, ФНО-альфа и ИФН-гамма, методов проведения физико-химических исследований и анализа биологической активности. Выбрана экспериментальная модель костных метастазов, методы оценки эффективности противоопухолевого и антирезорбтивного действия конъюгатов и конструкций. Разработана Программа экспериментальных исследований.
3. Наработана биомасса штаммов-продуцентов рекомбинантных ФНО-альфа и ИФН-гамма человека: образцы штамма E.сoli SG 20050/pTNF311Δ серий 010814, 020914 в количестве 26,7 г с содержанием целевого белка 31,3-37,6%; образец штамма E.сoli MH-1/pIFNΔ10 серии 051014 в количестве 29,4 г с содержанием целевого белка 20,4%. Получены образцы рекомбинантного аналога ФНО-альфа человека серии 010814 в количестве 55,1 мг с концентрацией белка 2,42 мг/мл и специфической активностью 0,8×10 8 Ед/мг и аналога ИФН-гамма человека в количестве 28,08 мг с концентрацией белка 0,6 мг/мл и специфической активностью 3,3×107 Ед/мг, по показателям качества соответствующие проектам НД.

Анализ современной научно-технической литературы по проблеме подтверждает тот факт, что выбранное направление является принципиально новым направлением создания лекарственных препаратов для лечения костных метастазов. Патентный поиск показал, что объект исследования обладает патентной чистотой.

Полученные результаты полностью соответствуют техническим требованиям к выполняемому проекту. В ходе реализации проекта будет создан новый лекарственный препарат для лечения костных метастазов, обеспечивающий адресную доставку противоопухолевых белков-цитокинов в костную ткань и костное микроокружение. Предполагается, что препарат будет использоваться для лечения запущенных форм рака, характеризующихся метастатическим поражением костной системы (рак молочной железы, предстательной железы, почечноклеточный рак и др.). В дальнейшем этот методический подход может быть использован при разработке новых средств лечения других видов костных патологий, таких как остепороз, остеопетроз и т.д., что позволит многократно расширить сферу применения данной разработки.

Комиссия Минобрнауки России признала обязательства по Соглашению на отчетном этапе исполненными надлежащим образом.